Defining the causal association between human beta papillomavirus infection, keratinocyte stem cells expansion and skin cancer development

I papillomavirus umani (HPV) sono piccoli virus nudi contenenti un genoma a doppia elica di DNA circolare di 8 kb che infettano gli epiteli squamosi stratificati cutanei e mucosali di differenti distretti corporei. Gli HPV possono stabilire infezioni latenti in individui sani, ma inducono anche lesioni neoplastiche benigne o maligne in base alle proprietà oncogene specifiche dei differenti genotipi. Fino ad oggi sono stati identificati più di 180 genotipi differenti di HPV che sono stati classificati in 5 generi sulla base dell’analisi filogenetica. Il genere Alpha (α-HPV) è il più caratterizzato e comprende i genotipi a tropismo mucosale associati all’ insorgenza di carcinoma a livello genitale (ad esempio HPV16 e 18). Gli HPV appartenenti al genere β (β-HPV) sono evoluzionisticamente distinti dal genere α e causano infezioni inapparenti o asintomatiche molto diffuse nella popolazione generale. Nei pazienti affetti da epidermodisplasia verruciforme (EV), una immunodeficienza primaria caratterizzata da un’alta suscettibilità all’infezione da β-HPV, questi virus replicano con alta efficienza, sviluppano il loro pieno potenziale trasformante, inducendo numerose lesioni simil verrucose con alto rischio di progressione a carcinoma cutaneo. Sebbene il loro coinvolgimento nel processo di carcinogenesi cutanea in pazienti immunocompetenti e immunosoppressi non-EV (con immunosoppressione primaria o acquisita) è ancora materia di dibattito, numerose evidenze epidemiologiche e sperimentali suggeriscono un ruolo carcinogenico di questi virus che inizia nelle fasi precoci e contribuisce alla patogenesi del carcinoma cutaneo. Il nostro gruppo ha dimostrato precedentemente la presenza di prodotti dei geni virali e l’amplificazione del genoma virale in lesioni cutanee precancerose derivate da pazienti trapiantati d’organo (OTR, Organ Transplant Recipient). Questi risultati rafforzano l’evidenza di un coinvolgimento dei β-HPVs nella patogenesi del carcinoma cutaneo. Sulla base dei dati già acquisiti, abbiamo studiato i meccanismi molecolari alla base dell’induzione del carcinoma cutaneo indotto da β-HPV in pazienti immunocompromessi attraverso differenti approcci, quali il modello di topo transgenico HPV8 e il saggio di tumorigenicita’ in vivo di tumori derivati da OTR. Pe capire il ruolo di β-HPV nello sviluppo del carcinoma cutaneo, è importante conoscere dove questo virus naturalmente si localizza. L’ipotesi attuale è che il reservoir di β-HPV risieda in cellule staminali con ciclo cellulare rallentato presenti nel follicolo pilifero (HF-KSC); tuttavia, la precisa popolazione di HF-KSC coinvolta nell’infezione latente di β-HPV è ancora sconosciuta. Per determinare il ruolo delle HF-KSC nel carcinoma cutaneo indotto da β-HPV, abbiamo utilizzato un modello di topo transgenico nel quale il promotore della cheratina 14 guida l’espressione della regione precoce di HPV8 (HPV8tg). I topi HPV8tg presentano uno spessore della cute piu’ ampio rispetto ai topi wild type e mostrano una cute iperproliferante. La proliferazione dei cheratinociti del follicolo pilifero è evidente nella popolazione di cellule staminali Lrig1+ (69 vs 55%, p<001, n=6), ma non lo è nelle popolazioni CD34+, LGR5+ e LGR6+. Questo è in linea con l’osservazione dell’espanzione dei cheratinociti Lrig1+ di 2,8 volte e dell’efficienza di formare colonie di 3.8 volte. In accordo con questi risultati, abbiamo osservato l’espressione nucleare di p63 in questa popolazione, nell’infindibulum e nella cute interfollicolare fiancheggiante, associata a un cambiamento di espressione tra la forma TA di p63 in ΔNp63 nella cute dei topi HPV8tg. Le cheratosi dei pazienti EV e alcune cheratosi attiniche (AK) di pazienti non EV mostrano un istologia simile associata alla riattivazione di β-HPV e all’espressione nucleare di p63 nell’ infindibulum e nella cute perifollicolare. Questi dati suggeriscono che il campo di cancerizzazione indotto da β-HPV inizia dalla “junctional zone” e predispone al carcinoma cutaneo.. Inoltre abbiamo realizzato un modello umanizzato di xenotrapianto ortotopico utilizzando tumori cutanei derivati da OTR. Questa tecnica permette di aumentare la disponibilità dei tumori cutanei – che è una delle limitazioni nell’ambito della ricerca sui tumori cutanei-, analizzare in dettaglio i meccanismi molecolari coinvolti nella tumorigenesi e identificare l’infezione e l’espressione di β-HPV in queste lesioni. Inoltre, questa tecnica permette di studiare la progressione della malattia da una situazione pre-cancerosa a una cancerosa, ad esempio da AK a SCC come riportato in questa tesi, che non può essere studiato a livello umano per la naturale necessità di rimuovere la lesione prima dell’evoluzione maligna. In questo contesto, rimane da stabilire se l’immunosoppressione faciliti la carcinogenesi anche attraverso la riduzione dell’immunosorveglianza. Per verificare questa ipotesi e generare un modello murino che ricapitolasse gli eventi che si verificano nei pazienti trapiantati, abbiamo incrociato i topi transgenici HPV8 (background genetico FVB/N) con i topi deficienti per il gene RAG2 (background genetico C57BL/6), che non producono cellule B e T. I risultati ottenuti fino ad ora con la generazione F2 indicano che l’immunosoppressione facilita la carcinogenesi anche inibendo l’immunosorveglianza del tumore, come dimostrato dai dati ottenuti; infatti,il numero di tumori cutanei nella cute dei topi HPV8+:Rag2-/- e il loro grado di displasia è risultato significativamente maggiore rispetto ai topi HPV8+:Rag2+/+. Nell'insieme, i risultati ottenuti in questo studio contribuiscono a chiarire la storia naturale dell’infezione da β-HPV e rafforzano l’ipotesi di un ruolo di questi virus nello sviluppo del tumore cutaneo.